Ein neuartiges injizierbares Hydrogel mit Polyetheretherketon zur Knochenregeneration im kraniofazialen Bereich

Wissenschaftliche Berichte Band 13, Artikelnummer: 864 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Polyetheretherketon (PEEK) ist ein organisches Material, das als Alternative für Titanimplantate eingeführt wird. Injizierbare Hydrogele sind der vielversprechendste Ansatz zur Knochenregeneration in der Mundhöhle, um Defekte mit unregelmäßigen Formen und Konturen konservativ zu füllen. In der aktuellen Studie wurden injizierbare hydrogele Aldehyd-Cellulose-Nanokristallin/Seidenfibroin (ADCNCs/SF) mit PEEK synthetisiert und ihre Fähigkeit zur Knochenregeneration bewertet. Struktur, intermolekulare Wechselwirkung und die Reaktion zwischen den Komponenten wurden in der Hydrogelstruktur bewertet. Die Zytokompatibilität der hergestellten Gerüste wurde an menschlichen Zahnpulpa-Stammzellen (hDPSCs) bewertet. Darüber hinaus wurde die Osteoinduktionskapazität von ADCNCs/SF/PEEK-Hydrogelen auf hDPSCs mithilfe von Echtzeit-PCR, Western Blot, Alizarinrot-Färbung und ALP-Aktivität bewertet. Die Knochenbildung in Defekten kritischer Größe im Schädel von Ratten wurde histologisch und radiologisch beurteilt. Die Ergebnisse bestätigten die erfolgreiche Herstellung des Hydrogels und seine Fähigkeit zur osteogenen Induktion auf hDPSCs. Darüber hinaus war in der In-vivo-Phase die Knochenbildung in der ADCNCs/SF/PEEK-Gruppe signifikant höher. Daher deutete die verstärkte Knochenregeneration als Reaktion auf PEEK-beladene Hydrogele auf das Potenzial hin, den Knochenverlust im kraniofazialen Bereich, insbesondere rund um die Zahnimplantate, zu regenerieren.

In den letzten Jahrzehnten stellte das Bone Tissue Engineering eine vielversprechende Alternative zur Rekonstruktion von Knochendefekten im kraniofazialen Bereich dar1,2,3. Knochendefekte in diesem Bereich treten aufgrund angeborener Anomalien, Infektionen und anschließender Knochenresorption durch Trauma, Tumorresektion und Zahnextraktion auf4,5. Diese Defekte beeinträchtigen die Lebensqualität der Patienten erheblich und sollten behandelt werden, um die maxillofaziale Funktion und Ästhetik wiederherzustellen6,7.

Dynamische Knochenstrukturen weisen bemerkenswerte Regenerationsfähigkeiten bei der Rekonstruktion von Defekten auf, die kleiner als die kritische Größe sind. Defekte kritischer Größe verfügen nicht über die Fähigkeit zur Selbstheilung und erfordern zusätzliche Rekonstruktionseingriffe8. Herkömmliche Ansätze zur Behandlung dieser Art von Knochendefekten, wie autologe/allogene Knochentransplantate und Metallprothesen, sind durch die Morbidität und den Mangel an Entnahmestellen, die Möglichkeit von Resorptionen sowie komplizierte Herstellung und Formgebung zum Füllen unregelmäßiger Defekte eingeschränkt9,10. Aufgrund dieser Einschränkungen können Knochengewebe-Engineering-Ansätze mit biologisch abbaubaren und biokompatiblen 3D-Polymerhydrogelen als potenzielle Kandidaten für die Steigerung der Wirksamkeit von Behandlungsprotokollen durch Verbesserung der Stammzellproliferation und -differenzierung in Betracht gezogen werden. Ähnliche Eigenschaften von Hydrogelen wie die native extrazelluläre Knochenmatrix (ECM) und die Bereitstellung osteogener Faktoren sind die Hauptmerkmale, die ein Hydrogel für die Knochenregeneration geeignet machen. Ein weiteres wesentliches Merkmal, das berücksichtigt werden sollte, ist die Injizierbarkeit dieser Hydrogele, die im Vergleich zu vorgefertigten Hydrogelen zahlreiche Vorteile bietet11,12,13. Diese injizierbaren Hydrogele unterstützen die Infiltration, Anlagerung, Proliferation und Differenzierung von Stammzellen hervorragend, wenn sie mit geeigneten Polymeren und Substanzen hergestellt werden. Darüber hinaus sind die einfache Handhabung, die minimalinvasive Verabreichung und die Füllung unregelmäßig geformter Knochendefekte neben der Bequemlichkeit für den Patienten die Vorteile dieser injizierbaren Hydrogele in der klinischen Anwendung14,15,16,17,18.

Zur Rekonstruktion von beschädigtem und verlorenem Knochengewebe wurden verschiedene Biomaterialien eingesetzt19,20,21. Polyetheretherketon (PEEK) ist ein vielversprechendes organisches und synthetisches Polymer mit teilkristalliner Struktur. Aufgrund seiner hohen Biofähigkeit, Strahlendurchlässigkeit und ähnlichen Elastizität wie natürlicher Knochen im Vergleich zu metallischen Materialien wie Titan (Ti)22,23,24 erfreut es sich immer größerer Beliebtheit. Darüber hinaus kam es den Berichten zufolge bei Titanimplantaten und deren Legierungen bei der Rekonstruktion von Knochendefekten im kraniofazialen Bereich zu Metallionenfreisetzung, Osteolyse, Allergenität und Metallkorrosion25,26. Die Anwendung von PEEK in verschiedenen Substraten und Materialien seit mehr als 40 Jahren bestätigt seine großen Möglichkeiten für die Anwendung von Biomaterialien. Als Hochleistungspolymer zeichnet sich PEEK durch eine hervorragende chemische Beständigkeit, eine hohe Schmelztemperatur von 340 °C, eine hervorragende Strahlungs- und Sterilisationsbeständigkeit, einen hohen Elastizitätsmodul von 3,7 bis 4,0 GPa und eine hohe Zugfestigkeit von 103 MPa27 aus. Unter den Prothesenmaterialien wird PEEK aufgrund seiner guten Hitzestabilität und ähnlichen mechanischen Eigenschaften wie natürlicher Knochen häufig als Komponente verwendet. Diese Eigenschaften tragen dazu bei, dass Verbundwerkstoffe auf PEEK-Basis die Knochenregeneration fördern und die Resorption benachbarter Knochen verzögern28. Eine breite Palette von Wirbelsäulenimplantaten wurde aus PEEK hergestellt, darunter Käfige, Stäbe und Schrauben, die so konzipiert sind, dass sie starr bleiben, während die Knochen allmählich miteinander verschmelzen29,30,31,32. Zu den bemerkenswertesten Merkmalen von PEEK, die es zu einem guten Material im kraniofazialen Bereich machen, gehören unter anderem hervorragende mechanische Eigenschaften, natürliche Strahlendurchlässigkeit und eine verringerte Wärmeumwandlung19,33. Darüber hinaus gibt es mehrere Hinweise auf eine verringerte Osteolyse, eine erhöhte Knochenbildung und eine unterstützende anfängliche Mineralisierung rund um PEEK-Implantate19. Einige Studien zeigten jedoch, dass dieses Substrat nicht so bioaktiv ist wie Ti; Daher schlugen sie die Einbindung von PEEK in andere Materialien vor22,34,35.

Aufgrund seiner bedeutenden Eigenschaften ist Seidenfibroin (SF) ein geeignetes Biopolymer für die Synthese von Hydrogelen. Dieses Material weist jedoch eine geringere mechanische Festigkeit auf, was durch Vernetzung mit anderen Materialien behoben werden könnte36. Cellulose-Nanokristalle sind natürliche Polysaccharide mit bemerkenswerten physikalisch-chemischen Eigenschaften, die diese Substanz zu einem wirksamen Verstärkungsmittel für biomedizinische Anwendungen, insbesondere zur Knochengewebezüchtung, machen37.

Obwohl verschiedene Studien die bemerkenswerten Eigenschaften von PEEK-basierten Materialien belegen, gab es keine Studien, in denen PEEK-haltige injizierbare Hydrogele mit In-situ-Gelierungsverhalten zur Verbesserung der osteogenen Fähigkeit dieses Materials zur Knochenregeneration untersucht wurden. Daher wurden in der aktuellen Studie die Hydrogele aus nanokristallinem Aldehyd-Cellulose/Seidenfibroin/PEEK (ADCNCs/SF/PEEK) synthetisiert und ihre Osteogenesekapazität sowohl in vitro als auch in vivo bewertet.

Die erfolgreiche Herstellung dieses Hydrogels und seiner porösen Struktur wurde durch Fourier-Transformations-Infrarotspektroskopie (FTIR), thermogravimetrische Analyse (TGA) und Rasterelektronenmikroskopie (SEM) charakterisiert. In der In-vitro-Phase wurde die Zytokompatibilität der hergestellten Hydrogele durch einen 3'(3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazoliumbromid) (MTT)-Assay an menschlichen Zahnpulpa-Stammzellen (hDPSCs) bewertet ). HDPSCs sind leicht zugängliche multipotente Stromazellen, die mit hoher Effizienz und geringer Morbidität aus Pulpagewebe extrahiert werden. Sie können für den Einsatz in klinischen Studien sicher kryokonserviert werden. Als Osteoblasten können diese Zellen dreidimensionale gewebte Knochengewebespäne synthetisieren und sich synergetisch in Endotheliozyten und Osteoblasten differenzieren. Diese mesenchymalen Stammzellen scheinen immunprivilegiert zu sein, da sie in allogene Gewebe eingepflanzt werden können und entzündungshemmende Wirkungen ausüben38. Die osteogene Differenzierung dieser Zellen auf hergestellten Hydrogelen wurde auch durch Alizarinrot-Färbung, alkalische Phosphataseaktivität (ALP), Echtzeit-PCR und Western Blot für die entsprechenden Marker gemessen. Darüber hinaus wurde der neu gebildete Knochen in einem Rattenschädeldefekt kritischer Größe mittels Histologie und Kegelstrahl-Computertomographie (CBCT) untersucht.

Die durchschnittlichen Gelierungszeiten von ADCNCs/SF-Hydrogelen mit und ohne PEEK betrugen (63,21 ± 6,35 s) bzw. (83,10 ± 9,21 s), was keinen statistisch signifikanten Unterschied aufwies.

FTIR-Spektren von ADCNCs, SF, PEEK, ADCNCs/SF und ADCNCs/SF/PEEK sind in Abb. 1 dargestellt. Das FTIR-Spektrum von Seidenfibroin zeigte starke Absorptionsbanden bei 1540 cm−1 und 1244 cm−1 (Amid II). und III), 1660 cm−1 (Amid I-, CO- und CN-Streckung) bzw. 3300 cm−1 (NH-Streckung). Die Banden bei 1500–1300 cm–1 und 1100–900 cm–1 könnten auch mit den CH-Biege- bzw. Skelettdehnungsbereichen in Zusammenhang stehen. Darüber hinaus wurde die -gly-gly--Sequenz der Seidenfibroinkette von der Bande bei 1016 cm−1 beobachtet. Das FTIR-Spektrum des PEEK zeigte den asymmetrischen Streckschwingungspeak für R–O–R bei 1217,06 cm–1, den Schwingungspeak des aromatischen Ringgerüsts bei 1593,49 cm–1 und den Streckschwingungspeak für C=O bei 1485,73 cm–1 bei 1648 cm-1; und symmetrischer Streckschwingungspeak für R–CO–R bei 925,29 cm−1. Darüber hinaus kann der Peak bei 835,27 cm−1 und 765,07 cm−1 auf die Biegeschwingungsabsorptionspeaks für C–H aus der Benzolringebene zurückgeführt werden. Die Substitution am aromatischen Ring in para-Position wurde bei 836,92 cm−1 beobachtet. Im Spektrum der ADCNCs kann die symmetrische Schwingung bei ~ 1742 cm−1 der Halbacetalbildung freier Aldehydgruppen der AD-CNCs zugeordnet werden. Nach der Herstellung von ADCNCs/SF-Hydrogel wurde aufgrund der chemischen Vernetzung zwischen Aminogruppen von SF und Dialdehydgruppen von ADCNCs ein neuer Absorptionspeak bei 1680 cm-1 beobachtet. Darüber hinaus bestätigte das Vorhandensein eines neuen Peaks bei 1648 cm−1 den erfolgreichen Einbau von PEEK in das ADCNCs/SF-Gerüst.

FTIR-Spektren von ADCNCs, SF, PEEK, ADCNCs/SF und ADCNCs/SF/PEEK.

Die Ergebnisse der thermogravimetrischen Analyse von ADCNCs/SF- und ADCNCs/SF/PEEK-Hydrogelen sind in Abb. 2 dargestellt. TGA-Kurven der Hydrogele zeigen einen Gewichtsverlust in drei Stufen. Die erste Stufe (30–210 °C) ist mit dem Verlust von absorbiertem und gebundenem Wasser verbunden, etwa 6 % Gewichtsverlust bei ADCNCs/SF- und ADCNCs/SF/PEEK-Hydrogelen. Die zweite Stufe, 210–310 °C, ist auf den Abbau von ADCNCs und SF mit einem Gewichtsverlust von 37 % zurückzuführen. Der dritte Gewichtsverlustschritt entspricht der Auflösung oder Neuordnung der Kette. Der bisherigen Literatur zufolge erhöht die Zugabe mineralischer Verbindungen wie PEEK das Restgewicht des thermischen Abbaus, was eine verbesserte thermische Stabilität darstellt39,40,41.

TGA-Kurven von ADCNCs/SF und ADCNCs/SF/PEEK.

Das rheologische Verhalten der entwickelten Hydrogele wurde durch Oszillationsrheologie ermittelt. Als Funktion der Kreisfrequenz wurde der Zusammenhang von Speicher (G′) und Verlustmodul (G“) der Hydrogele in Abb. 3 charakterisiert. Das rheologische Verhalten wird hauptsächlich durch die kovalenten Bindungen zwischen den Aminogruppen von SF und Aldehyd beeinflusst Funktionalität, elektrostatische und Wasserstoffbrückenbindung zwischen SF und ADCNCs und die Verstärkung im Netzwerk42. Die Ergebnisse zeigten, dass G'' für die SF/ADCNCs-Hydrogele mit PEEK kleiner als G′ war, was auf ein stabiles vernetztes Netzwerk schließen lässt, das durch den PEEK-Gehalt schnell verstärkt wird. Darüber hinaus wurde eine gute Grenzflächenkompatibilität zwischen SF, ADCNCs und PEEK beobachtet, da SF/ADCNCs/PEEK im Vergleich zu SF/ADCNCs eine 1,1-fach höhere G′-Größe boten.

Frequenzdurchlauf von ADCNCs/SF- und ADCNCs/SF/PEEK-Hydrogelen.

Die Ergebnisse der Abbaustudie zeigten eine Verringerung der Abbaurate in den ADCNCs/SF/PEEK-Hydrogelen aufgrund der Abnahme der Beweglichkeit der Netzwerkketten, was zu einer geringen Penetration von Wassermolekülen in die Hydrogelstruktur führte. Daher hatten ADCNCs/SF/PEEK-Hydrogele eine langsamere Abbaurate als ADCNCs/SF-Hydrogele (Abb. 4A).

(A) In-vitro-Abbauprofil von ADCNCs/SF und ADCNCs/SF/PEEK. (B) Quellungsgrad von ADCNCs/SF und ADCNCs/SF/PEEK-Hydrogelen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (n = 3) ausgedrückt.

Wie in früheren Studien festgestellt, hängen die Quelleigenschaften von Hydrogelen hauptsächlich von der Hydrophilie der funktionellen Gruppen, der Kristallinität und der mechanischen Festigkeit ab43. In diesem Zusammenhang zeigten die Ergebnisse, dass die Quellung der Hydrogel-Komposite 12 Stunden nach dem Eintauchen in PBS eine Gleichgewichtsquellung der Hydrogel-Komposite erreicht hatte (Abb. 4B). Dieser Befund deutete auf die schnell quellenden Eigenschaften von Hydrogel hin. Das Quellverhältnis des ADCNCs/SF-Hydrogels war statistisch höher als das der ADCNCs/SF/PEEK-Hydrogele, was bestätigt, dass die Zugabe von PEEK als Verstärkungsmaterial die Kristallinität der Matrix beeinflusste. Andererseits nahm das Quellverhältnis aufgrund seiner hohen Kristallinität und Hydrophobizität mit der Einarbeitung des PEEK ab.

Die Morphologie des PEEK-Pulvers in einem Bild mit geringer Vergrößerung zeigte, dass die PEEK-Partikel eine nahezu kugelförmige Form haben (Abb. 5a). Das stark vergrößerte Bild zeigte, dass die Oberfläche der Partikel relativ rau war (Abb. 5b). Der Verbundstoff wies miteinander verbundene poröse Strukturen auf (Abb. 5c). Die Morphologie von ADCNCs/SF/PEEK-Gerüsten mit höherer Vergrößerung ist in Abb. 5d dargestellt. Die SEM-Auswertungen zeigten ein homogenes poröses Gerüst. Darüber hinaus wurde die Adhäsion von hDPSCs an der Gerüststruktur durch REM nachgewiesen (Abb. 5e).

REM-Bild. (a) PEEK-Partikel bei geringer Vergrößerung, (b) PEEK-Partikel bei hoher Vergrößerung, (c und d) ADCNCs/SF/PEEK-Hydrogel; (e) Menschliche Zahnpulpa-Stammzellen auf hergestellten Hydrogelen.

Die Proliferation der hDPSCs wurde durch MTT-Assay 1, 3 und 5 Tage nach der Aussaat auf ADCNCs/SF- und ADCNCs/SF/PEEK-Hydrogelen bestimmt. Im Vergleich zur Kontrollgruppe (Zellen ohne Hydrogele) war die Lebensfähigkeit von hDPSCs in allen Gruppen erhöht (Abb. 6). Darüber hinaus nahm die Proliferation von auf Hydrogelen ausgesäten hDPSCs im Laufe der Zeit zu. Mit anderen Worten: Die Proliferation von hDPSCs wurde zeitabhängig deutlich erhöht. Im Allgemeinen wurde 3 und 5 Tage nach der Aussaat von Stammzellen auf ADCNCs/SF/PEEK-Hydrogelen ein signifikanter Anstieg des OD-Werts beobachtet.

Der MTT-Assay zeigte die Zytokompatibilität der synthetisierten Gerüste an. Die Proliferation von auf Hydrogelen ausgesäten hDPSCs nahm im Laufe der Zeit zu. Diese Proliferation war am dritten und fünften Tag nach der Aussaat von Stammzellen auf Hydrogelen deutlich erhöht. Kontrolle: DPSCs ohne gegenüberliegende Hydrogele, ADCNCs/SF: DPSCS, geimpft auf Hydrogel ohne PEEK, ADCNCs/SF/PEEK: DPSCS, geimpft auf Hydrogel mit PEEK (*P < 0,05).

Die ALP-Enzymaktivität wurde sieben Tage nach der Aussaat von hDPSCs auf Hydrogelen gemessen. Den Ergebnissen zufolge war die Expression dieses Enzyms in ADCNCs/SF/PEEK-Gruppen im Vergleich zu ADCNCs/SF- und Kontrollgruppen signifikant erhöht (P < 0,00). Die ALP-Aktivität in den Versuchsgruppen betrug 123,428, 228,5933 und 261,47 (IE/mg Protein) in der Kontroll-, ADCNCs/SF- und ADCNCs/SF/PEEK-Gruppe (Abb. 7.A).

(A) Die Aktivität der alkalischen Phosphatase stieg in beiden hergestellten Hydrogelen im Vergleich zur Kontrollgruppe deutlich an. (B) Eine Alizarinrot-Färbung wurde durchgeführt, um die Kalziumanreicherung in hDPSCs zu erkennen. Im Vergleich zur Kontrolle war die rote Farbintensität bei ADCNCs/SF- und ADCNCs/SF/PEEK-Hydrogelen deutlich höher. Darüber hinaus zeigte die Zugabe von PEEK zum Gerüstrückgrat eine drastisch höhere Mineralisierung im Vergleich zur Kontrollgruppe. Kontrolle: DPSCs ohne gegenüberliegende Hydrogele, ADCNCs/SF: DPSCS, geimpft auf Hydrogel ohne PEEK, ADCNCs/SF/PEEK: DPSCs, geimpft auf Hydrogel mit PEEK (*P < 0,05).

Die Kalziumablagerung von hDPSCs auf injizierbarem Hydrogel, das PEEK-Partikel enthielt, war deutlich erhöht, was durch die roten Flecken im Alizarin Red S-Färbetest nachgewiesen wurde (Abb. 7B).

Der Einfluss synthetisierter Hydrogele auf die Osteogenese von HDPSCs wurde anhand der Expression osteogener Marker, einschließlich Runx2, Osteocalcin (OCN) und COL1α1, sowohl auf Gen- als auch auf Proteinebene analysiert. Den Ergebnissen zufolge wiesen die ausgesäten Zellen auf ADCNCs/SF/PEEK höhere mRNA-Expressionsniveaus auf (Abb. 8A). Dieser Unterschied war im Vergleich zu ADCNCs/SF und Kontrollgruppen in allen untersuchten Genen signifikant. Die Western-Blot-Analyse ergab auch, dass die ADCNCs/SF/PEEK-Komponente zu einer deutlichen Hochregulierung der Expression der Runx2-, COL1α1- und OCN-Proteine ​​führte (Abb. 8B). Wie gezeigt, stimmten die Western-Blot-Ergebnisse mit den PCR-Daten überein. Die Ergebnisse zeigten, dass das Vorhandensein von PEEK-Partikeln im Hydrogel die Expression osteogener Gene und Proteine ​​in hDPSCs induzierte und deren Differenzierung zu Osteoblasten förderte.

(A) Die Expressionsniveaus der Gene Runx2, OCN und COL1A1 in hDPSCs, die nach 14 Tagen auf synthetisierten Hydrogelen ausgesät wurden, stiegen drastisch an. (B) Western Blot bewertete die Sekretion der gleichen Faktoren in den Proteinspiegeln nach 7 Tagen. Die Aussaat von hDPSCs auf den synthetisierten Hydrogelen erhöhte auch die Expression bewerteter osteogener Marker in den Proteinspiegeln. Kontrolle: DPSCs ohne Hydrogele, ADCNCs/SF: DPSCs auf ADCNCs/SF-Hydrogel gesät, ADCNCs/SF/PEEK: DPSCs auf Hydrogel mit PEEK gesät (*P < 0,05).

Zur Beurteilung der Knochenbildung im Defektbereich wurde 8 Wochen nach der Implantation der Hydrogele eine DVT-Analyse durchgeführt. Das Gesamtvolumen der Knochenbildung in den Defekten kritischer Größe betrug 28,59 ± 7,5990 mm3, während diese Mengen in den ADCNCs/SF- und ADCNCs/SF/PEEK-Gruppen 38,15 ± 11,63 mm3 und 52,5 ± 7,8 mm3 betrugen. Die Unterschiede zwischen den untersuchten Gruppen waren bei ADCNCs/SF/PEEK-Hydrogelen im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant höher (Abb. 9).

ADCNCs/SF/PEEK-injizierbare Hydrogele steigerten die Knochenbildung nach 8 Wochen drastisch, wie durch DVT nachgewiesen wurde. Der nahezu vollständige Verschluss erfolgte in der ADCNCs/SF/PEEK-Gruppe, während die ADCNCs/SF-Gruppe weniger Knochenvolumen im Defektbereich verursachte. Das Knochenvolumen (mm3) wurde an den Defektstellen aller Proben gemessen. Der signifikante Unterschied bestand zwischen ADCNCs/SF/PEEK-Gruppen mit Kontrolle. Kontrolle: Knochendefekte kritischer Größe ohne jegliche Behandlung, ADCNCs/SF: Knochendefekte kritischer Größe, gefüllt mit Hydrogel ohne PEEK, ADCNCs/SF/PEEK: Knochendefekte kritischer Größe, gefüllt mit Hydrogel mit PEEK (*P < 0,05).

Acht Wochen nach der Operation wurden in beiden Gruppen keine schweren entzündlichen oder infektiösen Reaktionen beobachtet. Die Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) in den Proben der Kontrollgruppe identifizierte Lamellenknochen, der von reifen Osteozyten und Knochenmark um den Defekt herum besetzt war. Der Rand des Knochendefekts war im Gewebeschnitt offensichtlich erkennbar, während um den Knochendefekt herum einige osteoblastische Zellen zu sehen waren. Diese Gruppe hatte keine signifikante Knochenregeneration (Abb. 10A). In der ADCNCs/SF-Gruppe begann die Knochenneubildung an der Injektionsstelle im Knochendefekt. Um den Defektbereich herum befanden sich einige Knochennadeln mit zentraler Mineralisierung, umgeben von Osteoblasten. Bindegewebe mit Fibroblasten und neuen Blutgefäßen sorgte in verschiedenen Teilen dieser Gruppe für den Heilungsprozess. Im Bindegewebe waren einige Entzündungszellen zu sehen; Allerdings gab es bei den Ratten keine offensichtlichen Entzündungszeichen. In dieser Gruppe wurde eine mäßige Knochenregeneration festgestellt, während es sich bei dem gefüllten Gewebe größtenteils um Bindegewebe handelte (Abb. 10B). In der PEEK-haltigen Gruppe war der Fortschritt einer stärkeren Knochenneubildung erkennbar. Der Defektbereich war mit vielen mikrozystischen Bereichen gefüllt, die die primäre Phase der Knochenbildung enthielten. Diese Gruppe hatte keine zellfreien Bereiche und der gesamte Defekt war mit regenerativem Gewebe gefüllt. Es wurden Bereiche im primären und fortgeschrittenen Stadium der Knochenbildung vorgestellt. Es wurde eine leichte Bildung der Knochenmatrix festgestellt. Um die Knochennadeln waren mehrere Osteoblasten nachweisbar. In einigen Bereichen war die Matrix ausgereift und durch die Ablagerung von Mineralien bildete sich ein neuer, aber ausgereifter Knochen, der Osteoidzellen enthielt. Es wurde Bindegewebe mit Fibroblasten gesehen, während es keine Hinweise auf Fremdkörperreaktionen gab (Abb. 10C).

Histologie von Proben. (A) Knochendefekte kritischer Größe ohne Behandlung: Im zentralen Teil des Schnitts wurde ein Knochendefekt festgestellt. Um den Knochendefekt herum war reifer Knochen nachweisbar, der das Knochenmark (A) enthielt. (B) Knochendefekte kritischer Größe, gefüllt mit Hydrogel ohne PEEK (ADCNCs/SF): Der Hauptbereich der Knochendefekte war mit Binde- und Fasergewebe (FT) gefüllt. An einigen Stellen wurden Knochennadeln mit zentraler Mineralisierung beobachtet (B). (C) Knochendefekte kritischer Größe, gefüllt mit einem Hydrogel, das PEEK (ADCNCs/SF/PEEK) enthält: Im Heilungsbereich waren verschiedene mikrozystische Bereiche vorhanden, die die primäre Phase der Verkalkung (A) und mehrere Inseln neuer Knochenbildung (B) enthielten . Die schwarzen Pfeile zeigen Osteoblasten um die Knochennadeln. Der Hohlraum war mit regenerativem Gewebe gefüllt, einschließlich Fasergewebe (FT) und Knochenmatrix. Oben rechts im Abschnitt ist reifer Knochen mit Osteoblasten (schwarze Kreise) zu erkennen.

In den letzten Jahrzehnten hat die Anwendung injizierbarer Hydrogele zur Rekonstruktion von Knochendefekten mit unregelmäßiger Größe und Form große Aufmerksamkeit erregt. Das Ziel der aktuellen Studie bestand darin, injizierbares Hydrogel mit PEEK zu entwickeln, um Knochendefekte kritischer Größe im Schädelbereich zu regenerieren. Diese chirurgisch anspruchsvollen Defekte müssen sorgfältig behandelt werden, um den verlorenen Bereich zu rekonstruieren und die gewünschte Funktion und Ästhetik zu erreichen. In situ injizierbare Hydrogele sind vielversprechende Ansätze, die eine einfache Handhabung sowie eine einfache und homogene Verteilung des Hydrogels in unregelmäßigen und großen Defekten ermöglichen, bevor das Hydrogel vollständig geliert. Darüber hinaus sind diese Materialien minimalinvasiv, was die Notwendigkeit großer Einschnitte verringert, die zu Patientenkomfort, Narbenbildung und Infektionen führen44,45.

Basierend auf den Ergebnissen der aktuellen Studie stellen injizierbare in situ bildende Hydrogele miteinander verbundene poröse Strukturen bereit. Diese Struktur bietet eine geeignete Oberfläche für Zelladhäsion, Nährstoff- und Abfallverteilung42. Die Ungiftigkeit hergestellter Hydrogele ist ein weiterer entscheidender Faktor für die Entwicklung von Biomaterialien. Die Zytokompatibilität des in dieser Studie entwickelten Hydrogels wurde durch MTT-Assay bestätigt. Darüber hinaus wurde die osteoinduktive Kapazität dieses Hydrogels sowohl in der In-vitro- als auch in der In-vivo-Phase beobachtet.

PEEK kann aufgrund seiner mechanischen und chemischen Eigenschaften als Hauptkandidat für den Ersatz metallischer Implantate angesehen werden. In einigen Literaturstellen wird es jedoch als Bio-Internet-Substanz beschrieben, was ein Hindernis für seine biologischen und klinischen Anwendungen darstellen kann29,46,47. Einige Studien zeigten, dass dieses Material nicht so viel Proliferation auslösen konnte wie andere ähnliche Materialien wie Titan19,48. Allerdings versucht man, diesen Mangel durch Oberflächenmodulation zu decken. Den Erkenntnissen zufolge werden Zellmorphologie und -proliferation direkt von der Oberflächenrauheit von Materialien beeinflusst49. Forscher haben gezeigt, dass eine mäßige Rauheit von PEEK zu einer deutlich besseren Zellanhaftung führt50,51. Darüber hinaus zeigten einige Studien, dass die Topographie eine wichtigere Rolle bei der Zellanhaftung spielt als die chemische Zusammensetzung51,52,53. Daher scheinen Zelladhäsion und -proliferation nicht nur von der chemischen Zusammensetzung, sondern auch von der Topographie der Substrate beeinflusst zu werden. PEEK hat proliferative Wirkungen in verschiedenen Zelllinien gezeigt54. Darüber hinaus zeigte eine systematische Überprüfung eine verbesserte Haftung, Proliferation, Biokompatibilität und Osteogenese auf der Oberfläche von PEEK-Implantatmaterialien22. In der aktuellen Studie zeigten die hergestellten ADCNCs/SF/PEEK-Hydrogele keine Zytotoxizität gegenüber hDPSCs. HDPSCs auf hergestellten Hydrogelen sorgten im Vergleich zur Kontrollgruppe für eine bessere Zellproliferation. Darüber hinaus wirkte sich die Hinzufügung von PEEK auf dem ADCNCs/SF-Rückgrat positiv auf diese Zellen aus. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Oberflächenrauheit von PEEK als Vorteil für die Zellproliferation angesehen werden könnte. Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, während die Rauheit der Oberfläche in Gegenwart von PEEK55 zunahm.

Um die Reaktion der hDPSCs auf hergestellte Hydrogele zu bewerten, wurden ALP-, AlZ-, Echtzeit-PCR- und Western-Blot-Tests durchgeführt. ALP ist als früher osto/odontogener Differenzierungsmarker bekannt, der für die folgende Mineralisierung wesentlich ist. Der zugrunde liegende Mechanismus hängt mit der Hydrolyse des Phosphatesters mit Alp als Transkriptionsfaktor zusammen, der die Osteoblastendifferenzierung fördern kann56,57. Die erhöhten Mengen an sekretiertem Phosphat in den ADCNCs/SF- und ADCNCs/SF/PEEK-Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe zeigten die höhere Sekretion dieses frühen Differenzierungsmarkers. Die Auswertung von Hydrogelen auf der Basis von Cellulose-Nanokristallen zeigte ein erhöhtes Maß an Alp-Aktivität auch in MC3T3-E1-Zelllinien58,59.

Die Alizarinrot-Färbung wurde angewendet, um das Mineralisierungspotenzial entwickelter Hydrogele auf hDPSCs zu bewerten. In diesem Test deuten die positive Färbung und die hohe Rotfärbung auf eine Ablagerung von Calciumphosphat und eine Mineralisierung hin37. PEEK-haltige Hydrogele zeigten höhere OD-Werte als ADCNCs/SF und die Kontrollgruppe, was auf ein höheres Mineralisierungspotenzial von ADCNCs/SF/PEEK-Hydrogelen hindeutet. Anionische Matrizen in der Gerüststruktur sind an die sezernierten Calciumionen gebunden, um Keimnischen zu bilden42. Die anderen Studien untersuchten die Kalziumablagerung in Seidenfibroin- und Cellulose-Nanokristall-Hydrogeln auf mesenchymalen Zellen des menschlichen Knochenmarks und legten nahe, dass dieses Rückgrat die Kalziumablagerung und die Zytoskelettbildung erhöhte37,60,61.

Osteogenese-Gene und Proteinexpression wurden in den untersuchten Gruppen mittels Echtzeit-PCR und Western-Blot-Techniken gemessen. Die Expression von drei osteogenen spezifischen Markern (Runx2, OCN und Col1α1) wurde sowohl auf Gen- als auch auf Proteinebene in hDPSCs gemessen, die hergestellten Hydrogelen ausgesetzt waren. Die Auswertung dieser Marker ergab eine höhere Expression in Zellen mit ADCNCS/SF und ADCNCS/SF/PEEK. Diese Ergebnisse legen nahe, dass das hergestellte Hydrogel eine große osteogene Induktionsfähigkeit für Anwendungen zur Knochenregeneration besitzt. Bei der natürlichen Knochenbildung gibt es zwei Phasen: die endochondrale und die intramembranöse Ossifikation. Ersteres erfordert Knorpelschablonen, während letzteres durch mesenchymale Kondensation erfolgt. Die Differenzierung mesenchymaler Stammzellen zu Osteoblasten umfasst verschiedene Transkriptions- und Signalfaktoren36,62. Beispielsweise ist die Expression von Runx2 für die Differenzierung mesenchymaler Stammzellen in den osteoblastischen Phänotyp63 zwingend erforderlich. Daher deuten die höheren Mengen dieses Markers in ADCNCS/SF und ADCNCS/SF/PEEK im Vergleich zur Kontrollgruppe auf ein höheres osteogenes Potenzial von hDPSCs nach Exposition gegenüber hergestellten Hydrogelen hin.

Der andere Faktor, der in unreifen mesenchymalen Stammzellen und Präosteoblasten exprimiert wird, ist Col1α1. Mittlerweile ist Osteocalcin der andere Marker, der sich in die Knochenmatrix einbetten und die Osteozyten bilden soll64,65. Es wurde über ein höheres osteogenes Potenzial mesenchymaler Stammzellen des Knochenmarks berichtet, wenn diese in Chitosan/Seidenfibroin-Cellulose-Hydrogele ausgesät wurden. Die Autoren stellten klar, dass funktionelle Hydrogelgruppen die Apatitbildung in der extrazellulären Matrix erleichtern60. Liu et al. zeigten die osteoblastische Differenzierungskapazität von mesenchymalen Stammzellen des Knochenmarks in 3D-Konstruktionen von PEEK66 an. Einige Studien deuten auf eine erhöhte osteogene Kapazität von PEEK hin, wenn es durch verschiedene Substanzen eingearbeitet oder modifiziert wird19,22,24,48. Das ADCNC/SF-Rückgrat trägt wesentlich zur Verbesserung der biologischen Eigenschaften dieses Materials bei. Daher erleichterte die geeignete Struktur der hergestellten Hydrogele die osteogene Differenzierung von DPSCs. Diese höhere Expression wurde in verschiedenen Studien mit ähnlichen Strukturen und Grundgerüstmaterialien sogar in Proteinspiegeln beobachtet37,67.

In dieser Studie verwendeten wir Rattenmodelle, um die Knochenbildung bei Knochendefekten kritischer Größe zu bestimmen. Es wurde eine CBCT-Analyse durchgeführt und eine Nachahmungssoftware verwendet, um die 3D-Rekonstruktion und das Knochenvolumen zu bewerten. Darüber hinaus wurden Knochenproben einer H&E-Färbung unterzogen. Der neu gebildete Knochen wurde in beiden Versuchsgruppen beobachtet, die das Hydrogel enthielten. Der Heilungsprozess war in diesen Gruppen im Vergleich zu Knochendefekten kritischer Größe ohne Behandlung überlegen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Mikroumgebung der Hydrogele für die Knochenregeneration geeignet ist. Über die positiven Auswirkungen von Biomaterial auf der Basis von Zellulose-Nanokristallen auf die Regeneration von Knochengewebe wurde bereits früher berichtet37,60. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Gerüste auf Seidenfibroinbasis mit Keramik und anderen bioaktiven Molekülen die Expression osteogener Marker und die Knochenregeneration bei Knochendefekten steigerten68. Die aktuelle Studie umfasste Seidenfibroin mit nanokristalliner Cellulose und PEEK als injizierbares, in situ bildendes Hydrogel. Obwohl wir die biomechanischen Eigenschaften des neu gebildeten Knochens nicht bewerteten, bestätigten unsere Ergebnisse die wünschenswerte osteogene Induktion zur Regeneration von Schädeldefekten kritischer Größe. Für zukünftige Studien sind weitere Untersuchungen zur Optimierung dieses Gerüsts für tragende Bereiche wie Kiefer unter Berücksichtigung weiterer Studiengruppen, einschließlich orthopädischer Implantate auf PEEK-Basis, erforderlich.

Seidenkokons von Bombyx mori (B. Mori) wurden vom Silkworm Research Center (Gilan, Iran) erhalten. Mikrokristallines Cellulosepulver (MCC) wurde freundlicherweise von der Zahravi Pharmaceutical Company (Iran) gespendet. Natriumperiodat (NaIO4), Dimethylsulfoxid (DMSO), Lithiumbromid (LiBr), Natriumcarbonat (Na2CO3) und Dialysebeutel (MWCO = 3000 und 12.000 Da) wurden von Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) gekauft ). PEEK wurde ebenfalls von Merck bezogen (mittlere Partikelgröße 80 Mikrometer, GF75065755).

Seidenraupenkokons wurden in Stücke geschnitten und dann 30 Minuten lang in kochender Na2CO3-Lösung entschleimt, um die Sericinproteine ​​zu entfernen. Anschließend wurden die Proben gründlich gespült, mehrmals mit entionisiertem Wasser versetzt und über Nacht an der Luft getrocknet. Anschließend wurden die Proben 4 Stunden lang bei 60 °C in 9,3 M Lithiumbromid (1 g in 4 ml) eingeweicht und dann 4 Tage lang dialysiert (3 kDa MWCO), um LiBr zu entfernen. Die erhaltene Lösung wurde zentrifugiert, um Rückstände für die weitere Verwendung zu entfernen.

Die CNC-Lösung wurde gemäß unserer vorherigen Arbeit erstellt69,70. Danach wurde die Reaktion der CNC-Lösung mit NaIO4-Lösung (300 µg/ml) 8 Stunden lang im Dunkeln durchgeführt. Um die Reaktion zu beenden, wurden der Lösung 600 µL Ethylenglykol zugesetzt und die Lösung anschließend zur weiteren Reinigung dialysiert. Das Endprodukt wurde gefriergetrocknet, um das ADCNC-Pulver zu erhalten.

Zu diesem Zweck wurden die vorbereiteten Seidenfibroin- (~ 7 %) und ADCNCs-Lösungen (~ 0,5 Gew.-%) in zwei Fässer überführt und dann in eine Form injiziert und anschließend 30 Minuten lang aufbewahrt, um das Hydrogel zu erhalten (Abb. 11.A). ). Das Hydrogel wurde mit einer Doppelzylinderspritze mit einer Gauge-Nadel (21 G) hergestellt. Für das PEEK enthaltende Hydrogel wurde das Pulver (10 Gew.-%) der ADCNCs-Lösung zugesetzt.

(A) Injizierbares ADCNCs/SF/PEEK-Hydrogel. (B) Knochendefekt kritischer Größe (8 mm) im Schädel der Ratte (C) ADCNCs/SF/PEEK-Hydrogel im erzeugten Defekt (D) Inzisionsverschluss.

Wir haben den Aldehydgehalt berechnet, um den Oxidationsgrad von ADCNCs71,72 zu bewerten. Zuerst wurden 2 ml Hydroxylaminhydrochloridlösung (0,35 M) zu 1 ml ADCNCs-Lösung (pH = 5,0) gegeben und dann 8 Stunden lang bei 55 °C gerührt. Die Zufuhrwerte der NaOH-Lösung (0,5 M) wurden als Vc und Vb für die Titration von ADCNCs und CNCs aufgezeichnet. Das Molekulargewicht von ADCNCs beträgt etwa 162 g/moL. Dann wurde der Aldehydgehalt durch die folgende Gleichung geschätzt:

Dabei ist m das Trockengewicht (g) der ADCNCs-Probe.

In dieser Studie wurde das TGA-Gerät (TGA/SDTA 851/Mettlear Toledo, Spanien) unter Stickstoffatmosphäre (20 ml/min) verwendet. Der Temperaturbereich reichte von 30 °C bis 600 °C bei einer Heizrate von 10 °C/min. In komprimierten KBr-Pellets wurden die FTIR-Spektren von Hydrogelen mit einer Auflösung (4,0 cm−1) und 16 Scans pro Minute mit Bruker Tensor 27 aufgezeichnet. Der Wellenzahlbereich wurde auf 400–4000 cm-1 eingestellt. Zur Berechnung der Gelierungszeit wurde der umgekehrte Röhrchentest in Betracht gezogen.

Die Analyse des Frequenz-Sweep-Tests wurde mit einem Frequenzbereich von 1 bis 100 rad/s und einer regelmäßigen Dehnung von ɤ = 0,01 abgeschlossen. Bewertet wurden die dynamische Viskosität, der Speichermodul (G‘) und der Verlustmodul (G‘‘).

Die Hydrogele wurden in 20 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH = 7,4) eingeweicht. Anschließend wurden die Proben in einen Schüttelinkubator bei 37 °C gestellt. Nach vorgegebenen Zeitintervallen (1, 2, 4, 6 und 8) wurden die Stücke aus dem Medium entnommen und unter Vakuum getrocknet. Der Abbau wurde mithilfe der folgenden Gleichung quantifiziert:

Dabei ist Wi die anfängliche Polymertrockenmasse und Wf die jeweils trockene Polymermasse.

Zur Beurteilung der Quellfähigkeit von Hydrogelen wurden die angegebenen Proben in entionisiertes Wasser bei 37 °C getaucht. Zusammenfassend wurde zunächst das Trockengewicht der Hydrogele gemessen (Wd) und dann die gequollenen Hydrogele nach 1, 6, 12, 24, 48, 72 und 96 Stunden gewogen (Ws). Der Quellungsgrad (SD) wurde gemäß der Gleichung aufgezeichnet:

HDPSCs wurden von der Shahid Beheshti University gekauft und auf Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium mit hohem Glucosegehalt (DMEM/HG; Kat.-Nr.: 31600083; Gibco; USA) kultiviert, das 10 % fötales Rinderserum (FBS; Gibco) und 1 % Penicillin/Streptomycin enthielt (Gibco, USA). Nachdem eine Konfluenz von 80 % erreicht war, wurden die Zellen trypsinisiert (Gibco, Singapur) und für In-vitro-Tests auf den sterilisierten Gerüsten ausgesät.

Die Oberflächenmorphologie und -struktur von ADCNCS/SF/PEEK-Gerüsten mit und ohne hDPSCs wurden drei Tage nach der Aussaat mittels SEM bewertet. Vor der Bewertung wurden hDPSCs wie kürzlich beschrieben in 2,5 % Glutaraldehyd auf den Gerüsten fixiert73. Nach der Fixierung wurden die Hydrogele mit hDPSCs unter Verwendung einer abgestuften Reihe von Alkoholkonzentrationen (50, 70, 90 und 100 %)74 dehydriert. Anschließend wurden Gerüste mit und ohne Stammzellen in drei Exemplare geschnitten und mit einer dicken Goldschicht überzogen. Zur Charakterisierung dieser Proben wurde FE-SEM 1430 vp (MIRA3 FEG-SEM – Tescan, Tschechisch) angewendet.

Die Auswirkungen synthetisierter Gerüste auf hDPSCs wurden mittels MTT-Assay bewertet. Kurz gesagt, 5 × 103 Zellen wurden auf ADCNCs/SF- und ADCNCS/SF/PEEK-Gerüsten in den 96-Well-Platten ausgesät. hDPSCs wurden ohne Gerüste auf der Polystyroloberfläche von drei Vertiefungen in derselben Platte kultiviert und als Kontrollgruppe betrachtet. Nach 1, 3 und 5 Tagen wurden 50 μl 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl-2, 5-diphenyltetrazoliumbromid) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)-Lösung (5 mg/ml) hinzugefügt zum Medium und nach 4-stündiger Inkubation bei 37 °C und 5 % CO2; Das Medium wurde durch 100 μl DMSO ersetzt und die Farbänderung der violetten Formazankristalllösung wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (BioTek, USA) bei der Wellenlänge von 570 nm gemessen.

Die Kalziumakkumulation von hDPSCs, die auf ADCNCS/SF- und ADCNCS/SF/PEEK-Hydrogelen ausgesät wurden, wurde mittels Alizarinrot-Färbung gemessen, um die Mineralisierung dieser Zellen zu bestimmen. 5 × 105 Zellen wurden auf den synthetisierten Hydrogelen ausgesät, die wie folgt in Platten mit 6 Vertiefungen gegeben wurden; Drei Vertiefungen waren mit ADCNCS/SF-Hydrogelen gefüllt, drei Vertiefungen waren mit ADCNCS/SF/PEEK gefüllt und drei Vertiefungen enthielten hDPSCs ohne Gerüste, die als Kontrollgruppe galten. Nach vierzehn Tagen wurden die Zellen mit 2 % Paraformaldehyd (Sigma-Aldrich Co.) fixiert und mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen 40 Minuten lang im Dunkeln bei Raumtemperatur mit 40 mM Alizarinrot (pH 4,2, Sigma-Aldrich Co.) gefärbt. Abschließend wurden die Vertiefungen dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen und trocknen gelassen. Die Kulturplatten wurden unter einem optischen Mikroskop fotografiert und zeigten mineralisierte Knötchen, die mit einem dunkelroten Zentrum und einem hellroten Randbereich auftraten. Zur quantitativen Analyse wurde nach 30-minütiger Zugabe von 10 %iger Essigsäurelösung und Schütteln 10 %ige Ammoniumhydroxidlösung zugegeben, um die Reaktion zu neutralisieren. Die Farbintensität wurde mit einem ELISA-Lesegerät (BioTek, USA) bei 405 nm bestimmt.

Die Aktivität der alkalischen Phosphatase von beimpften hDPSCs auf synthetisierten Hydrogelen wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt (ALP-Assay-Kit, Pars Azmoon, Iran). Ähnliche Platten wurden unter den gleichen Bedingungen wie beim ARS-Test hergestellt. Sieben Tage nach der Zellaussaat wurden die Proben zweimal mit PBS gewaschen und in alkalischem Lysepuffer lysiert. Nach 45-minütiger Inkubation wurde die Konzentration von P-Nitrophenol bei 405 nm gemessen und die Ergebnisse als IU/mg Protein angegeben.

1 × 106 hDPSCs wurden auf den synthetisierten Gerüsten kultiviert, die auf den Platten mit sechs Vertiefungen platziert wurden. Nach vierzehn Tagen wurde die Gesamt-RNA gemäß den Herstellungsanweisungen mit Ambion TRIzol-Puffer (Kat.-Nr.: 15596–026, Invitrogen, USA) extrahiert und die Qualität der erhaltenen RNA mit Nanodrop (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) bestimmt. . Anschließend wurde 1 μg Gesamt-RNA für die cDNA-Synthese mit einem cDNA-Synthesekit (Kat.-Nr.: YT4500) verwendet. Das Expressionsniveau von drei Genen für die osteogene Differenzierung wurde durch spezifische Primer bewertet, darunter Runx2, OCN und COL1A1 (Tabelle 1). Das β-Actin-Gen wurde als Housekeeping-Gen zur Normalisierung verwendet. Die Expression wurde mit einem RT-PCR-System (LightCycler 96) gemessen. Alle Daten wurden in drei separaten Experimenten und dreimal wiederholt. Die Datenanalyse erfolgte nach der Pfaffl-Methode75.

Der Immunblotting-Assay wurde durchgeführt, um das Ausmaß der Expression osteogener Proteine ​​in hDPSCs zu bewerten, die auf ADCNCS/SF- und ADCNCS/SF/PEEK-Hydrogelen ausgesät wurden. HDPSCs wurden ohne Gerüste ausgesät und dienten als Kontrollgruppe. Dieser Test wurde gemäß den in unserer vorherigen Studie76 beschriebenen Standardprotokollen durchgeführt. Kurz gesagt, nach sieben Tagen wurden die Zellen in eiskalter Zelllysepufferlösung (NaCl, NP-40 und Tris-HCl), einschließlich Cocktail-Enzyminhibitoren, lysiert. Die Lösungen wurden beschallt und dann 20 Minuten lang bei 14.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde mit dem Picodrop-Spektrophotometersystem (Modell-Nr.: PICOPET01, Seriennummer 000212/1) auf den Gesamtproteingehalt analysiert und mit der SDS-PAGE-Methode aufgelöst. Die folgende primäre Antikörperlösung wurde zu den Proben gegeben und dann über Nacht bei 4 °C inkubiert; Runx2 (RUNX2 (F-2), Kat.-Nr.: sc-390351, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), Kollagen Typ Ι Alpha Ι (COL1α1 (3G3), Kat.-Nr.: sc-293182, Santa Cruz Biotechnology, Inc.), Osteocalcin (OCN (FL-100), Kat.-Nr.: sc-30044, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) und β-Actin (Kat.-Nr.: sc-47778, Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Die Proben wurden mit sekundärem HRP-konjugiertem Anti-IgG-Antikörper (Kat.-Nr.: sc-2357, Santa Cruz Biotechnology, Inc.) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Zum Nachweis der immunreaktiven Blots wurde das ECL-Plus-Lösungskit (BioRad) verwendet. Die Visualisierung der reaktiven Proteine ​​im Blot-Prozess erfolgte gemäß den Anweisungen des Herstellers. Dieses Experiment wurde dreifach durchgeführt.

Zwölf ausgewachsene Wistar-Ratten, 8 Wochen alt und 3500–400 g schwer, wurden in die aktuelle Studie aufgenommen und zufällig in drei Gruppen eingeteilt. Jede Gruppe bestand aus vier Ratten, die sieben Tage lang einzeln in pathogenfreien Boxen gehalten wurden, um sie an die Bedingungen im Tierstall anzupassen. Zu dieser Bedingung gehörten eine Temperatur von 22 ± 5 °C, eine Luftfeuchtigkeit von 50–60 % und ein 12-stündiger Dunkel-/Hell-Zyklus. Alle Ratten hatten Zugang zu normalem Rattenfutter und Wasser in der gleichen Menge und im gleichen Zustand.

Um den Osteogeneseeffekt synthetisierter Hydrogele zu bewerten, wurde im Schädeldach jeder Ratte ein Defekt mit einem Durchmesser von 8 mm erzeugt (Abb. 11B). Zur Anästhesie wurde eine Mischung aus Ketamin (Rotexmedica, Trittau, Deutschland) und Xylazin (Alfasan, Niederlande) (45/10 mg/kg) intramuskulär injiziert. Der Schädeldachbereich wurde rasiert und mit Povidon-Jod desinfiziert. Danach wurde mit der chirurgischen Klinge Nr. 13 ein etwa 25 mm scharfer Schnitt vorgenommen. Zur Retraktion des Gewebes wurde der Periostelevator nach Prichard verwendet. Dann wurde mit dem Trepanbohrer des Zahnimplantat-Kits (DASK, Dentium Advanced Sinus Kit, Südkorea) ein 8 mm großer Defekt erzeugt, während die Operationsstelle mit steriler Kochsalzlösung gekühlt wurde. Die bei vier Ratten entstandenen Defekte wurden mit ADCNCS/SF gefüllt, während die anderen vier Ratten ADCNCS/SF/PEEK-Hydrogele erhielten (Abb. 11C). Die Defektstellen der verbleibenden vier Ratten waren mit keinem Material gefüllt und wurden als Kontrollgruppe betrachtet. Die Einschnitte wurden mit nicht resorbierbarer chirurgischer schwarzer geflochtener Seide der Stärke 3/0 USP (HURTEB Medical Devices, Teheran, Iran) vernäht (Abb. 11D). Bei postoperativen Schmerzen wurde bei jeder Ratte unmittelbar nach der Operation und 24 Stunden später eine subkutane Injektion von Piroxicam (Exir, Teheran, Iran) durchgeführt. Nachdem die Ratten aktiv geworden waren, wurden sie in ihre Boxen gebracht und erhielten, wie erwähnt, Futter und Wasser. Die Operationsstellen wurden mit Gentamicin-Hautsalbe abgedeckt, um Infektionen vorzubeugen. Die Nähte wurden sieben Tage nach der Operation entfernt.

Nach acht Wochen wurden die Ratten durch eine Überdosierung von Pentobarbital (100 mg/kg) getötet und die defekten Bereiche wurden mit 2 mm zusätzlichen Sicherheitsrändern vom Schädeldach jeder Ratte entfernt. Nach der Entnahme der Knochenproben wurden die Kadaver durch Bestattung entsorgt.

Die Knochenstücke wurden mit einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, um das anhaftende umgebende Gewebe zu entfernen, und in 10 % neutral gepuffertem Formalin (Pars Chemie, Teheran, Iran) fixiert. Die Bildung neuer Knochen wurde mithilfe einer radiologischen (CBCT) und histologischen (H&E) Bewertung analysiert.

Nach der Tötung der Ratten und der Entnahme der Knochensegmente wurden die Proben mit einem Cone Beam Computed Scan (CBCT, NewTom VGi, Verona, Italien) gescannt. Die Richtung des Kegels wurde parallel zur koronalen Oberfläche von Knochendefekten platziert, wie zuvor beschrieben77. Um eine 3D-Rekonstruktion zu erstellen, wurde die Analyse mit Mimics Medical 21.0 (Materialise, Leuven, Belgien) durchgeführt und das Gesamtvolumen der Knochenbildung gemessen. Kurz gesagt wurden DICOM-Dateien in die Software hochgeladen und für die Rekonstruktion lagen die unteren und oberen Schwellenwerte zwischen 0 und 700 Hounsfield-Einheiten. Das gesamte Knochenvolumen wurde im zylindrischen Bereich (8 mm × 1 mm) gemessen. Für jede Gruppe wurden vier Defektmodelle berechnet und die Daten als Mittelwert ± SD angegeben.

Im Anschluss an die CBCT-Analyse wurden alle Proben entkalkt. Dabei wurde zur Entkalkung 3 % Salpetersäure (7697-37-2, Sigma, USA) verwendet78. Nach der Entkalkung wurden die Proben halbiert und durch den Gradienten von Ethanollösungen in einem Gewebeprozessor (MeyMed, DS 2080/H, Teheran, Iran) dehydriert. Die dehydrierten Proben wurden in Paraffinwachsblöcke (HistoWax, SCILAB, UK) eingebettet. Die Proben wurden mit einem Rotationsmikrotom (DID SABZ, DS 4055, Urmia, Iran) in histologische Objektträger mit 5 μm geschnitten, dann auf Glasobjektträger übertragen und mit Eindeckmedium (05-BMHM100, Bio Mount HM, Mailand, Italien) verklebt. Hämatoxylin (PadtanTeb, Teheran, Iran) und Eosin (CARLO ERBA) wurden durchgeführt, um die Knochenneubildung unter dem Lichtmikroskop (Olympus) zu beobachten.

Statistische Analysen wurden mit der Prism-Software (Version 8.0, GraphPad, San Diego, CA, USA) durchgeführt. Der Kolmogorov-Smirnov-Test analysierte die Normalität und Homogenität der Datenverteilung. Die kontinuierlichen Werte mit Normalverteilung wurden als Mittelwert ± SD angegeben und mittels Student-t-Test, einfaktorieller ANOVA und Tukey-Post-hoc-Analyse analysiert. Ein P-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Alle Experimente der aktuellen Studie wurden durch die veröffentlichte Richtlinie „The Care and Use of Laboratory Animals“ (NIH-Veröffentlichung Nr. 85–23, überarbeitet 1996) bestätigt und gemäß den ARRIVE-Richtlinien berichtet und von der Ethikkommission der Universität Tabriz genehmigt Medizinische Wissenschaften (IR.TBZMED.REC.1400.103), die der Helsinki-Erklärung nachgekommen sind.

Alle während dieser Studie generierten und/oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel enthalten. Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich.

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Der Vizekanzler für Forschung der Medizinischen Universität Tabriz dankt für die finanzielle Unterstützung dieser Studie.

Diese Studie wurde auf der Grundlage einer an der Medizinischen Universität Tabriz registrierten Dissertation (Nummer 65692) durchgeführt. Dieses Institut war nicht an der Gestaltung der Studie, der Sammlung, Analyse und Interpretation von Daten sowie dem Verfassen von Manuskripten beteiligt.

Zentrum für zahnmedizinische und parodontale Forschung, Fakultät für Zahnmedizin, Medizinische Universität Täbris, Täbris, Iran

Mahdieh Alipour

Ernährungsforschungszentrum, Medizinische Universität Täbris, Täbris, Iran

Marjan Ghorbani

Abteilung für orale Radiologie, Fakultät für Zahnmedizin, Medizinische Universität Täbris, Täbris, Iran

Masume Johari Khatoonabad

Stammzellenforschungszentrum, Medizinische Universität Täbris, Täbris, Iran

Marziyeh Aghazadeh

Abteilung für Oralmedizin, Fakultät für Zahnmedizin, Medizinische Universität Tabriz, Daneshgah St., Golgasht St., Tabriz, 5166614711, Iran

Marziyeh Aghazadeh

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MA, MA und MG trugen zur Gestaltung der Experimente, zur Überarbeitung des Manuskripts und zur Überwachung aller Experimente bei. MA, MA und MG führten alle Experimente durch und analysierten die Daten. MJK half bei den radiologischen Untersuchungen. MA, MG und MA haben das Manuskript geschrieben und Diagramme gezeichnet. Die Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Marziyeh Aghazadeh.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Alipour, M., Ghorbani, M., Johari Khatoonabad, M. et al. Ein neuartiges injizierbares Hydrogel mit Polyetheretherketon zur Knochenregeneration im kraniofazialen Bereich. Sci Rep 13, 864 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-022-23708-6

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Eingegangen: 16. April 2022

Angenommen: 03. November 2022

Veröffentlicht: 17. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-23708-6

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